diff --git a/DADA2_output/ASVs_raw.fasta b/DADA2_output/ASVs_raw.fasta new file mode 100644 index 0000000000000000000000000000000000000000..8ca85d5fd4b46943e6e74c9f95ea63e5382aa3fa --- /dev/null +++ b/DADA2_output/ASVs_raw.fasta @@ -0,0 +1,27145 @@ +>ASV1 +GGATACTCAACGTATCTACCTTATTATAAGTGTAAAGAAGTTGTTTCAAACTCAAAAACCAACATTATAAATAAAAATTT +CATCCATCTCTCATCGATACAAACCCCTCATATACAAATTGTATCAACAATATAGAACATATTCTTTCCATACAATTTTA +TGAGACGTGTTTGGTTGAATATGGAATTTAAGAAAGAAATAAAAAACATTTAAATATTGTGATGTAAAACAAGTCATAAA +CAGACCTTTGCATCACTCATTGCTTCCTTTTCTTTTTTGGACGACCAGTATCACTCATTGCATCCTTTTCATACACCAGG +CGAATTCCCCAGCAGCGTAGTTCTTCCCACTTCCTGTACAACTCATATACCTCCAACATGTAATAATCATTTGGATTCTT +CCCTTCTTTATTGCCTTCTCCATTATTCCACAATGTTTCAAATGGTATGTAGACGCAACAAATGTAACGATCGATGGACC +CCCCATGTAGATGGGTTCTGTACTTCAAGGAATATTTTCTTTCAGGGTCAGATTTGCAGACCAATGTAGCTTCTAAATAT +GTGTGGCTTCGTGTGGTAGAACCATAACTTATCCAAAAACCCATGAATTTATCGGTATACCAAGATGGGTTCAGATCAAT +TGAGATCCTATTTTGATTTATAAACCGATCATAATCAAACAACTCTGGAATTCCGATTCGATCAGGAAAAAAAATGAGAA 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+"RyiharPL.bc1024--bc1117" 11370 8545 7618 7618 67.0008795074758 +"RyiharPL.bc1024--bc1118" 21389 15876 10663 10663 49.8527280377764 +"RyiharPL.bc1026--bc1121" 4361 3894 3894 3894 89.291446915845 +"RyiharPL.bc1026--bc1124" 4616 4038 4037 4037 87.4566724436742 +"RyiharPL.bc1026--bc1126" 3523 3076 3075 3075 87.2835651433438 +"RyiharPL.bc1026--bc1139" 3747 3285 3282 3282 87.5900720576461 +"RyiharPL.bc1026--bc1147" 4382 3842 3841 3841 87.6540392514833 +"RyiharPL.bc1026--bc1149" 3892 3443 3442 3442 88.4378211716341 +"RyiharPL.bc1026--bc1154" 6489 5738 5730 5730 88.3032824780398 +"RyiharPL.bc1026--bc1157" 4853 4244 4242 4242 87.4098495775809 diff --git a/Dada2_pipeline_var_PacBio_v4-3.Rmd b/Dada2_pipeline_var_PacBio_v4-3.Rmd new file mode 100755 index 0000000000000000000000000000000000000000..0a4ad651b7c121bec0f7d31a1ab98323afef106d --- /dev/null +++ b/Dada2_pipeline_var_PacBio_v4-3.Rmd @@ -0,0 +1,388 @@ +--- +title: "dada2 microbiome pipeline v.4.3" +author: "Simeon Rossmann, Marie L. Davey" +date: "16.12.2019" +output: + pdf_document: default + html_document: default +last_modified: "Simeon Rossmann (SWR)" +date_modified: "20.11.2020" +version: 4.3 +--- + +This is an R markdown document for the analysis of MiSeq amplicon sequencing data. In order to customise the pipeline, search 'CHANGE ME' to find different settings you should adjust according to your data. All parameters requiring changes are located within the first 4 chunks. After the fourth chunk has been run, you can simply click 'Run'\>'Run all chunks below' in order to process the data + +Comment SWR: A new chunk was added to allow for quick reanalysis of taxonomy and pooled analysis of multiple samples after error inference. Small changes in chunk 4 (exporting seqtab.RDP in addition) were made to facilitate this. Therefore it's not recommended to 'Run all chunks below' from chunk 4 in this version. + +## Changelog + +### Ampseq variant + +This variant is geared towards sequencing runs with multiple primers. It takes a list of primers as input for the cutadapt processing instead of a single primer pair. + +### v4 update + +Comment SWR: Two more chunks were added to integrate [LULU](https://www.nature.com/articles/s41467-017-01312-x) post-processing into this pipeline. The first of the two new chunks is a shell script chunk that generates a match list (most similar ASVs for each ASV) using vsearch. The match list can also be generated by other means (f. eks. BLAST). The second of the new chunks is the core LULU chunk that takes the seqtab_nochim file from the dada2 analysis and the match list and performs the LULU post-processing with standard parameters. After this, a new seqtab_nochim, ASV-fasta and RDP taxonomy (optional) are generated in a lulu-subdirectory. + +#### v4.3 + +This update addresses inconsistencies in code usage between authors that were the likely cause of occasional warning messages and errors when creating files and directories in-function on some machines/setups. These problems occurred inconsistently and were not reproduced but seemed to be fixed by cleaner file path encoding. + +- minor code format fixes: + + - implementation of file path concatenation cleaned up by replacing all uses of `paste0()` for file paths with `file.path()` and removal of leading and closing slashes `/` + - replaced all instances of in-code object assignment using `=` with `<-` to clearly distinguish it from user assignable objects and argument assignment in functions. This means that objects assigned with `=` are intended for user input while objects assigned with `<-` are not to be directly manipulated by users. + +- other format fixes: + + - improved cosmetics when knitting by manually adjusted line breaks in code chunks + - added spaces surrounding `=` and following `,` to conform with best practices + - more consistent line spacing in code chunks + - Better text formatting in the Markdown text portions + +#### v4.2 + +- improved cutadapt with quality control and fwd primer removal, can be run through R in separate chunk +- filterAndTrim option expanded with trimLeft to remove the first n 5' bases regardless of content + +#### v4.1 + +- fixed an error when attempting to plot empty files +- fixed an error when attempting to sample more files than available for plotting + + +## Setup R Environment + +Comment SWR: If the OS is Linux, this chunk now passes the path and marker variables to the shell script chunk, making it unnecessary to specify this separately below and avoiding issues with misspelled variables. It is possible that this also works with Mac OS, but this was not included since no Mac machine was available for testing. + +```{r setup, eval=FALSE} +############set paths and marker name +# CHANGE ME to the directory (ABSOLUTE FILEPATH e.g. on Linux /home/usr/...) +# containing the fastq files (can be zipped). +path = "/home/simeon/Documents/PacBio/Barcoded_samples" +#CHANGE ME to the AmpSeq project identifier, will be used for folder naming. +marker = c("DADA2_test") + + +#set knitr chunk options +knitr::opts_chunk$set(echo = TRUE) +knitr::opts_chunk$set(eval = FALSE) +knitr::opts_chunk$set(tidy = TRUE) +knitr::opts_chunk$set(root.dir = file.path(path)) + +#load libraries for R session +library(dada2) +library(phyloseq) +library(ggplot2) +library(Biostrings) +library(grid) +library(gridExtra) +library(ShortRead) +library(tidyverse) + +# Get info on the operating system. If Linux, make 'path' and 'marker' available +# globally, if not, warn that the script needs additional attention. +os <- Sys.info()['sysname'] +if (os == "Linux") { + Sys.setenv(projectpath = path) + Sys.setenv(marker = marker) +}else{ + cat(os, "Please run this script on Linux, + it is no longer tested and optimized for Windows") +} +``` + +# Pacbio pre-processing +This is an experimental chunk to test pre-processing of HiFi PacBio samples for DADA2 + +```{r PacBio-pre-processing-and-QC} +#### NO FURTHER CHANGES NEEDED IN THIS CHUNK #### +#list of primers (implemented later) +#pacbio_fwd_primer_fasta <- "/home/simeon/Documents/AmpSeq/Test_Katie/primers_fwd.fasta" +#pacbio_rev_primer_fasta <- "/home/simeon/Documents/AmpSeq/Test_Katie/primers_rev.fasta" + +#Check if Marker folder exists, otherwise create it +outpath <- file.path(path, marker) +dir.create(outpath) +dir.create(file.path(outpath, "primer_trim")) +dir.create(file.path(outpath, "quality_trim")) +dir.create(file.path(outpath, "dada2_output_files")) +#list all fastq.gz files in path +pacbio_fastqs <- list.files(path, pattern="fastq.*", full.names=TRUE) + +#read primers +#fwds <- Biostrings::readDNAStringSet(pacbio_fwd_primer_fasta) +#revs <- Biostrings::readDNAStringSet(pacbio_rev_primer_fasta) + +#no_primers_path <- file.path(outpath, "noprimers", basename(pacbio_fastqs)) +#no_primer_reads <- dada2::removePrimers(pacbio_fastqs, no_primers_path, ) + +lens.fn <- lapply(pacbio_fastqs, function(fn) nchar(dada2::getSequences(fn))) +lens <- do.call(c, lens.fn) +hist(lens, 100) + +# SWR: Make a list of fastqs for quality plotting that excludes very small +# files (default is < 100 bytes) which may cause problems in quality plotting +# and exit the chunk with error +min_file_size <- function(files, minsize=10000){ + info <- file.info(files) + index_bigs <- which(info$size > minsize) + keep <- files[index_bigs] +} + +pacbio_fastqs_big <- min_file_size(pacbio_fastqs) + +#sample_number <- if (length(pacbio_fastqs_big) < 10) length(pacbio_fastqs_big) else 10 + +#plts_trim <- lapply(sample(pacbio_fastqs_big, sample_number), +# dada2::plotQualityProfile) + +#m_plts <- marrangeGrob(plts_trim, nrow = 2, ncol = 1) +#ggsave(file.path(outpath, "qual_plots.pdf"), +# m_plts, width = 20, height = 26, unit = "cm", dpi = 300) + +#print(plts_trim) +``` + +## set parameters for dada2 +This chunk contains several options for dada2 that will be used in the processing of the trimmed reads. The settings are saved to a file with a time stamp. + +```{r, set_params, eval=FALSE} +# CHANGE ME use "TRUE" to plot quality profiles for each sample, and "FALSE" to +# speed up analysis by skipping this step (plotting takes some time) and "SUB" +# to plot a subset of 10 samples +plotQC = "FALSE" + +# CHANGE ME according to the quality of the sequencing run. This determines the +# maximum expected errors for the reads during the filtering step. A reasonable +# value for PacBio HiFi reads is 2. +my_maxEEf = 2 + +# CHANGE ME according to the quality of the sequencing run. This is a PHRED score +# quality treshold - all sequences will be truncated at the first base with a +# quality score below this value +my_truncQ = 3 + +# CHANGE ME according to the marker used - this is the minimum length of the +# reads after trimming +my_minLen = 1000 + +# SWR: CHANGE ME to TRUE and give a value (number of bases) to collapse ASVs +# with an overlap of 'Collaps_minOverlap' (recommended to be the length of the +# shortest ASV that is identical to a longer one). This is only recommended to +# be used in cases where a number of ASVs occur that differ in length but are +# otherwise identical. If this frequently occurs, it may be an issue of primer +# trimming. +Collapse_overlapping = FALSE +Collapse_minOverlap = 200 + +#### NO FURTHER CHANGES NEEDED IN THIS CHUNK #### +# DO NOT CHANGE for AmpSeq, unless you are sure what you're doing! +my_minBootstrap = 80 +assign_taxonomy = "FALSE" +tax_database = "none" +``` + +## Processing chunk +#### DO NOT ALTER SCRIPT BEYOND THIS POINT!!! + +Comment SWR: This chunk now passes the output directory to a global variable on Linux, so that the shell script chunk that generates the match list can access it. + +```{r, dada2, eval=FALSE} +# Write parameter file +parameters <- paste( + paste("Run on", format(Sys.time(), "%d/%m/%y %H:%M")), + paste("Path: ",path),"Samples:", + paste(c(sapply(strsplit(basename(sort( + list.files(file.path(path, marker), + pattern = "fastq.gz", + full.names = TRUE))), "_"), `[`, 1)), collapse = ";"), + paste("Database type:",tax_database), + "\ndada2 Parameters\n", + paste("maximum expected errors R1:",my_maxEEf), + paste("minimum length: ",my_minLen), + paste("truncate at first instance of Qscore: ",my_truncQ), + paste("taxonomy bootstrap threshold: ",my_minBootstrap), + paste("Collapse overlapping ASVs: ", Collapse_overlapping), + paste("Minimum overlap if collapsing overlapping ASVs:", + Collapse_minOverlap), + sep = "\n") +write.table(parameters, file.path(outpath, paste0("parameters_PacBio_DADA2", + format(Sys.time(), "%d-%m-%y_%H%M") ,".txt")), + row.names = FALSE) + +# Create lists of forward and reverse file names and a list of sample names +#pacbio_fastqs <- sort(list.files(file.path(path, marker,"trim"), +# pattern = "_R1_001.fastq(.*)trim.fastq.gz", +# full.names = TRUE)) + + +#Extract sample names +sample.names <- sapply(strsplit(basename(pacbio_fastqs), "\\.fastq"), `[`, 1) + + + ###################################################################################### + # Forward Reads Only + ################################################################################### + + # Create paths for the filtered files in a subdirectory called filtered/ + + filtFsR1 <- file.path(outpath, "quality_filtered", + paste0(sample.names, "_filt.fastq.gz")) + + outp <- file.path(outpath, "dada2_output_files") + + # Filter sequences + outR1 <- filterAndTrim(pacbio_fastqs, filtFsR1, + maxEE = my_maxEEf, truncQ = my_truncQ, minLen = my_minLen, + maxLen = 9999, + maxN = 0, rm.phix = FALSE, compress = TRUE, multithread = TRUE) + head(outR1) + write.table(outR1, file.path(outp, "out.txt")) + + #if (plotQC == "TRUE") { + #Plot Forward/Reverse Quality scores for each sample (not strictly + # necessary, time intensive) + # pl <- lapply(c(fnFL), plotQualityProfile) + # print(pl) + # ml <- marrangeGrob(pl, nrow = 2,ncol = 1) + # ggsave(file.path(outp, "qualityplots_fwd.pdf"), + # ml, width = 20, height = 26, unit = "cm", dpi = 300) + #} + + #if (plotQC == "SUB") { + # Plot Forward/Reverse Quality scores for each sample (not strictly + # necessary, time intensive) + # sample_number <- if (length(fnFL) < 10) length(fnFL) else 10 + # pl <- lapply(sample(c(fnFL), sample_number), plotQualityProfile) + # print(pl) + # ml <- marrangeGrob(pl, nrow = 2, ncol = 1) + # ggsave(file.path(outp, "qualityplots_fwd.pdf"), + # ml, width = 20, height = 26, unit = "cm", dpi = 300) + #} + + # dereplicate + derepFsR1 <- derepFastq(filtFsR1[outR1[,2] > 0], verbose = TRUE) + # Name the derep-class objects by the sample names + names(derepFsR1) <- sample.names[outR1[,2] > 0] + + # Train dada2 to your dataset + errFR1 <- learnErrors(derepFsR1, multithread = TRUE, + errorEstimationFunction=PacBioErrfun, BAND_SIZE=32) + saveRDS(errFR1, file.path(outp, paste0("errs.rds"))) + + #eFplot <- plotErrors(errFR1, nominalQ = TRUE) + #ggsave(file.path(outp, "R1_error_profile.pdf"), + # eFplot, width = 20, height = 26, unit = "cm", dpi = 300) + + # sample inference + dadaFsR1 <- dada(derepFsR1, err = errFR1, multithread = TRUE) + + + # make sequence table and distribution table for sequence lengths + seqtabR1 <- makeSequenceTable(dadaFsR1) + ## SWR: If Collapse_overlapping=TRUE, collapses identical sequences together + # based on an overlap specified in 'Collapse_minOverlap'. + if (Collapse_overlapping == TRUE) { + seqtabR1 <- collapseNoMismatch(seqtabR1, minOverlap = Collapse_minOverlap, + orderBy = "abundance", identicalOnly = FALSE, + vec = TRUE, verbose = FALSE) + } + dim(seqtabR1) + table(nchar(getSequences(seqtabR1))) + # RDP can't assign taxonomy to sequences shorter than 50bp, so filter to > 50bp + seqtabR1 <- seqtabR1[,nchar(colnames(seqtabR1)) > 49] + + ## SWR: save RDS format seqtab to allow for merging of multiple runs and later + # analysis without rerunning the whole pipeline + saveRDS(seqtabR1, file.path(outp, "seqtab.rds")) + + # remove chimeric sequences + seqtabR1.nochim <- removeBimeraDenovo(seqtabR1, method = "consensus", + multithread = TRUE, verbose = TRUE) + dim(seqtabR1.nochim) + # calculate percent of sequences that are non-chimeric + sum(seqtabR1.nochim)/sum(seqtabR1) + write.table(seqtabR1.nochim, file.path(path, marker, + "R01_only", "seqtabR1.nochim")) + + ## SWR: additional .RDS output table for easy downstream use in e.g. phyloseq + saveRDS(seqtabR1.nochim, file.path(path, marker, + "R01_only", "seqtab_nochim.rds")) + + # output table for each sample + getN <- function(x) sum(getUniques(x)) + if (min(outR1[,2]) > 0) { + trackR1 <- cbind(outR1, sapply(dadaFsR1,getN), rowSums(seqtabR1.nochim), + rowSums(seqtabR1.nochim)/outR1[,1]*100) + colnames(trackR1) <- c("input", "filtered", "denoisedF", + "nonchim","percent_retained") + rownames(trackR1) <- c(sample.names) + } else { + trackR1 <- cbind(outR1[outR1[,2] > 0,], sapply(dadaFsR1, getN), + rowSums(seqtabR1.nochim), + rowSums(seqtabR1.nochim)/outR1[,1][outR1[,2] > 0]*100) + trackR1 <- rbind(trackR1,cbind(outR1[,1][outR1[,2] == 0], + outR1[,2][outR1[,2] == 0], + NA,NA,NA)) + colnames(trackR1) <- c("input", "filtered", "denoisedF", + "nonchim","percent_retained") + rownames(trackR1) <- c(sample.names[!outR1[,2] == 0], + sample.names[outR1[,2] == 0]) + } + + head(trackR1) + write.table(trackR1, file.path(outp, "trackR1.txt")) + + if (assign_taxonomy == "TRUE") { + taxaR1 <- assignTaxonomy(seqtabR1.nochim, tax_database, multithread = TRUE, + minBoot = my_minBootstrap, outputBootstraps = TRUE) + sum(rownames(taxaR1[[1]]) == colnames(seqtabR1.nochim)) == nrow(taxaR1[[1]]) + tmp <- cbind(rownames(taxaR1[[1]]), taxaR1[[1]], taxaR1[[2]]) + rownames(tmp) <- paste0("ASV", 1:length(colnames(seqtabR1.nochim))) + tmp <- data.frame(tmp) + write.table(tmp, file.path(path, marker, + "R01_only", "taxonomy_ASVs_NC_R1.txt")) + + ## SWR: save RDS file omitting bootstrap values for downstream use in + # e.g phyloseq + saveRDS(taxaR1$tax, file.path(outp, "taxa.rds")) + + tmp2 <- cbind(t(seqtabR1.nochim),tmp) + rownames(tmp2) <- paste0("ASV", 1:length(colnames(seqtabR1.nochim))) + write.table(tmp2, file.path(path, marker, + "R01_only", "seqtabR1.nochim_withtax.txt")) + + #write raw ASVs to a fasta file + seqsnochimR1 <- DNAStringSet(colnames(seqtabR1.nochim)) + seqsnochimR1@ranges@NAMES <- paste0("ASV",1:length( + colnames(seqtabR1.nochim))) + writeXStringSet(seqsnochimR1, file.path(path, marker, + "R01_only", "ASVs_raw.fasta"), + format = "fasta") + + #write ASVs with taxonomy in the header to a fasta file + seqsnochim <- DNAStringSet(colnames(seqtabR1.nochim)) + seqsnochim@ranges@NAMES <- paste0("ASV", + 1:length(colnames(seqtabR1.nochim)), + "|","|", + paste(tmp$Kingdom, tmp$Phylum, tmp$Class, + tmp$Order, tmp$Family, tmp$Genus, + tmp$Species, sep = ";")) + writeXStringSet(seqsnochim, file.path(path, marker, + "R01_only", "ASVs_withtax_R1.fasta"), + format = "fasta") + } else { + #write raw ASVs to a fasta file + seqsnochimR1 <- DNAStringSet(colnames(seqtabR1.nochim)) + seqsnochimR1@ranges@NAMES <- paste0("ASV",1:length( + colnames(seqtabR1.nochim))) + writeXStringSet(seqsnochimR1, file.path(path, marker, + "R01_only", "ASVs_raw.fasta"), + format = "fasta") + } +} + +#make paths available to subsequent chunks +dada2_dir <- outp +``` diff --git a/README.md b/README.md index a73b4f6dbf45e8cbbc133372e258094977a40ecc..bbf5d04a61870902a25bf62505d5b4fdbfb7b34e 100644 --- a/README.md +++ b/README.md @@ -1,3 +1,5 @@ # Rysto supplementary code This repository contains supplementary code and intermediary files for the submitted manuscript "Diversity of the _Rysto_ gene conferring resistance to potato virus Y in wild relatives of potato" by Paluchowska et al. + +Raw data deposited in the SRA was demultiplexed using Lima (see lima_command.txt) and ASVs were determined from the resulting files using the script in "Dada2_pipeline_var_PacBio_v4-3.Rmd". The resulting ASVs and sequence table are found in the folder "DADA2 output". diff --git a/lima_command.txt b/lima_command.txt new file mode 100644 index 0000000000000000000000000000000000000000..a3d264dfafa62ea0e3f9640e433b15ac7db3bdd0 --- /dev/null +++ b/lima_command.txt @@ -0,0 +1 @@ +lima --split-named xxxx.gz barcodes.fasta xxxx.demux.fastq